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有机羧酸和无机酸皆可用于混合酸酐的形成。然而，仅有几个得到了广泛的实际应用，多数情况下，采用氯甲酸烷基酯。过去频繁使用的氯甲酸乙酯，目前主要被氯甲酸异丁酯所替代。
由羧基组分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐，其氨解反应的区域选择性依赖依赖于两个互相竞争的羰基的亲电性和（或）空间位阻。在由N保护的氨基酸羧酸盐（羧基组分）和氯甲酸烷基酯（活化组分，例如源于氯甲酸烷基酯）形成混合酸酐时，亲核试剂胺主要进攻氨基酸组分的羧基，形成预期的肽衍生物，并且释放出游离酸形式的活性成分.当应用氯甲酸烷基酯（R1＝异丁基、乙基等）时，游离的单烷基碳酸不稳定，立即分解为二氧化碳和相应的醇。然而，对于亲核进攻的区域选择性，也有一些相反的报道，产物为氨基甲酸酯和原来的N保护氨基酸组分。
为了形成混合酸酐，将N保护的氨基酸或肽分别溶于二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、乙酸乙酯或DMF中，用等当量的三级碱（N－甲基哌啶、N－甲基吗啉、N－乙基吗啉等）处理。然后，在－15℃－－5℃，剧烈搅拌的同时加入氯甲酸烷基酯以形成不对称酸酐（活化）。经短时间活化后，加入亲核性氨基酸组分。如果作为铵盐使用（需要更多的碱），必须避免碱的过量使用。如果严格按照以上的反应条件，混合酸酐法很容易进行，是最有效的缩合方法之一。
Benoiton和他的同事对混合酸酐的稳定性，减少副产物氨基甲酸酯和消旋等方面进行了深入研究，由此进一步了解了反应机理，并提高了该方法的缩合效率，目前该方法已获得广泛应用。通过研究过量氨基甲酸酯产生的原因,尤其是在异亮氨酰基和缬氨酰基的情况下，发现以二氯甲烷为溶剂和N－甲基哌啶作为三及碱能防止这一主要副反应。混合酸酐对水解有较高稳定性，因此，可以用水洗涤有机相来纯化混合酸酐。从氯甲酸烷基酯制得的混合酸酐的稳定性依赖于使用的烷基。由Boc-、Z-和 Fmoc-的保护氨基酸和氯甲酸异丙酯制得的混合酸酐能够被分离纯化，比从氯甲酸乙酯或氯甲酸异丁酯获得的混合酸酐更稳定。当没有合适的亲核试剂时，混合酸酐在有机溶剂中的分解起始于环化，生成2－烷氧基－5（4H）－恶唑酮，同时释放出二氧化碳和醇R2－OH，副产物为对称酸酐和酯。
在混合酸酐缩合法的实际应用中，有以下几方面需要注意：虽然含水的DMF对于混合酸酐的形成和随后的缩合反应是一个好的溶剂，但是，正如在Z-Gly-Xaa-OH(Xaa=Ala,Leu,Val,Phe)与H－Val-OEt的反应中所遇到的，它促进消旋的程度比使用四氢呋喃或卤化试剂为溶剂时要高得多。氯甲酸异丙酯优氯甲酸乙酯或异丁酯。有趣的是，在DMF或N－甲基吡咯烷酮中，氯甲酸乙酯活化比氯甲酸异丁酯活化引起的消旋更少。尽管如此，从氯甲酸乙酯制取的混合酸酐，以三乙胺作为三级碱在目前几乎没有实用价值。最初，分别在Nα－甲基磺酰基、Nα－三苯甲基、Nα－三氟乙酰基保护的氨基酸活化中观察到混合酸酐法的副反应。
有时特戊酸（2,2－二甲基丙酸）被推荐作为活化基，用于混合酸酐的合成，对于Nα－酰基保护的天冬酰胺尤其如此。类似地，这种不对称酸酐由Nα－酰基氨基酸和特戊酰氯制得，并且与氨基亲核试剂反应的产率高。特戊酸叔丁基的强+I效应降低了它的羰基的亲电性，同时还因为空间位阻的影响，使亲核试剂在活化的氨基酸上发生预期的区域选择性进攻。从机理上考虑，这里也要提到酰基磷翁盐作为活性中间体在肽缩合中的应用.
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